Walidacja metod analitycznych [PRZEWODNIK]

Walidacja metod analitycznych [PRZEWODNIK]

Walidacja metod analitycznych jest procesem mającym na celu wykazanie i udokumentowanie przydatności danej metody analitycznej do określonego wcześniej zastosowania. Prowadzenie procesu walidacji metod analitycznych jest wymogiem normy ISO I7015 (norma obowiązująca w przypadku akredytacji laboratorium) oraz wymogiem ICH (z ang. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Humań Use – branża farmaceutyczna).

Celem niniejszego przewodnika jest:

  • określenie wymaganych kroków do przeprowadzenia procesu walidacji i przeglądu metod analitycznych oraz dostarczenie systematycznej metodyki gwarantującej jednolite podejście do walidacji metod analitycznych w laboratoriach (w szczególności laboratoriach wykonujących analizy surowców, półproduktów i wyrobów gotowych w przedsiębiorstwach branży farmaceutycznej, produktów kosmetycznych i suplementów diety, kontroli środowiska oraz weryfikacji czyszczenia),
  • zapewnienie zgodności sposobu prowadzenia walidacji metod analitycznych w laboratoriach z wymaganiami ICH.

W przypadku metod (technik) analitycznych, dla których zdefiniowano specyficzne wymagania walidacyjne zawarte w odpowiednich normach, metodykę prowadzenia walidacji opisaną w niniejszym przewodniku można modyfikować w oparciu o wymagania, ujęte w odrębnych procedurach i/lub instrukcjach (dotyczy to m.in. metod mikrobiologicznych oraz metod spektroskopii NIR).

Definicje z związane z walidacją metod analitycznych

  • Selektywność metody analitycznej – jest to zdolność do nie budzącej wątpliwości oceny zawartości i identyfikacji analitu w obecności innych składników, których występowanie jest spodziewane. Mogą to być zanieczyszczenia pochodzące z syntezy, produkty rozkładu, placebo itp.
  • Liniowość metody analitycznej – jest to zdolność uzyskiwania liniowej zależności pomiędzy sygnałem analitycznym, a stężeniem oznaczanego składnika
  • Precyzja metody analitycznej – wyraża stopień zgodności pomiędzy wynikami pomiarów uzyskanych przez wielokrotną analizę tej samej jednorodnej próby
  • Dokładność metody analitycznej – wyraża przybliżenie zgodności pomiędzy wartością przyjętą jako prawdziwą, a wartością zmierzoną
  • Zakres metody analitycznej – jest to przedział stężeń, dla którego udowodniono, że metoda analityczna posiada odpowiedni poziom precyzji, dokładności oraz liniowości
  • Walidacja matrycowa – jest to podejście walidacyjne, które polega na przeprowadzeniu badań walidacyjnych tylko dla wybranych surowców/produktów, które są przedstawicielami pewnej szerszej grupy. Można ją stosować tylko w przypadku, jeżeli istnieje ku temu naukowe uzasadnienie.
  • Odporność metody analitycznej – jest miarą zdolności metody analitycznej do dawania niezmiennych wyników pod wpływem małych rozmyślnie wprowadzonych zmian parametrów
  • Limit oznaczalności (LOQ, z ang. limit of quantification) metody analitycznej – najmniejsza ilość analitu w próbie, jaka może być oznaczona ilościowo z odpowiednią precyzją i dokładnością
  • Limit detekcji (LOD, z ang. limit of detection) metody analitycznej – najmniejsza ilość analitu w próbie, która może być wykryta
  • Nominalne stężenie (NS) – dla substancji aktywnej jest to stężenie, które odpowiada zawartości analitu przewidzianej w specyfikacji danego materiału; w przypadku zanieczyszczeń jest to górny limit zawartości danego zanieczyszczenia
  • Warunki stresowe – warunki znacznie odbiegające od tych przewidzianych dla przechowywania preparatu w okresie ważności, mające przyspieszyć degradację preparatu; warunki te mogą obejmować działanie temperatury, światła, wilgotności, czy też oddziaływanie odpowiednich odczynników
  • Analit – substancja oznaczana w danej metodzie analitycznej
  • Sygnał analityczny – mierzony parametr, którego wielkość zależy od stężenia lub własności oznaczanej substancji, np. absorbancja, pole powierzchni piku, natężenie prądu, objętość zużytego titranta, średnica plamki w TLC, itp.
  • Poziom raportowania – stężenie zanieczyszczenia od którego uzyskany wynik analizy jest raportowany w sposób ilościowy
  • ARL – z ang. Acceptable Residual Limit; dopuszczalny limit pozostałości zanieczyszczenia na powierzchni urządzenia; wyznacza nominalne stężenie w przypadku metod do weryfikacji czyszczenia
  • SST – z ang. System Suitability Test, test przystosowania systemu
  • SSC – z ang. System Suitability Criteria, kryteria przystosowania systemu

Opracowanie metody analitycznej

Opracowanie metody analitycznej przeprowadź godnie z wymaganiami farmakopei dotyczących danej techniki analitycznej. Dopuszczalne jest połączenie fazy opracowywania metody z badaniami realizowanymi na potrzeby jej walidacji. Walidowana metoda analityczna powinna opisywać wszystkie etapy niezbędne do wykonania analizy i zawierać informacje o analizowanych próbach, stosowanych wzorcach odniesienia, przygotowaniu odczynników, wykorzystywanej aparaturze oraz procedurze obliczeń.

Ocena konieczności walidacji metody analitycznej

Wszystkie metody analityczne muszą zostać poddane ocenie pod kątem konieczności objęcia ich procesem walidacji. Domyślnie metody są uznawane za wymagające walidacji. Jeżeli w danym przypadku istnieje uzasadnienie do rezygnacji z walidacji metody musi ono zostać udokumentowane i zatwierdzone w formularzu wyłączenia metod z walidacji. Jeżeli metoda analityczna nie wymaga walidacji, należy taką informację wprowadzić do rejestru walidacji/transferów metod analitycznych. Ocena konieczności walidacji metody analitycznej jest wymagana dla metod transferowanych, które są oceniane na etapie transferu. Dopuszczalne jest przygotowanie jednego formularza wyłączenia z walidacji dla wielu metod, np. dla danego produktu.

Klasyfikacja metody i zdefiniowanie zakresu walidacji metody analitycznej

Zdefiniuj zakres walidacji (listę parametrów walidacyjnych) w oparciu o wytyczne niniejszego Przewodnika. Dla nowo opracowanych metod zalecane jest przeprowadzenie oceny krytyczności parametrów metody.

Zakres merytoryczny prowadzenia walidacji jest różny w zależności od planowanego przeznaczenia danej metody. Aby zapewnić systematyczne i spójne podejście, metody analityczne podzielono na cztery główne klasy:

Klasa A – identyfikacja substancji

Klasa B – oznaczanie ilościowe zawartości składników aktywnych lub środków pomocniczych w gotowych produktach farmaceutycznych oraz zawartości składników aktywnych w surowcach farmaceutycznych

Klasa C – oznaczanie zanieczyszczeń lub produktów rozpadu w surowcach i gotowych produktach farmaceutycznych oraz w badaniach środowiskowych, w tym walidacji mycia

Klasa D – badanie cech charakterystycznych, np. test uwalniania substancji czynnej lub test rozkładu wielkości cząstek

Proces weryfikacji metody musi obejmować wstępną ocenę, w skład której wchodzi między innymi analiza doświadczenia, wiedzy i przeszkolenia personelu laboratorium, w celu ustalenia, czy są one wystarczające do przeprowadzenia weryfikacji, analiza złożoności procesu oraz sprzętu i przyrządów związanych z jej przeprowadzeniem, analiza złożoności materiałów, jakie mają być poddawane badaniu.

Przygotowanie protokołu walidacji metody

Protokół walidacji metody analitycznej musi zawierać następujące informacje:

  • nazwę produktu i oznaczanych substancji
  • limity specyfikacji dla oznaczanych substancji
  • listę wymaganych parametrów walidacyjnych wraz z odpowiednimi kryteriami akceptacji
  • metodykę prowadzenia badań, tzn. sposób prowadzenia testów, ilość prób, liczbę oznaczeń dla każdej próby, itp.

Podstawowe informacje dotyczące metodyki oraz domyślne kryteria akceptacji są opisane w niniejszym Przewodniku. W Przewodniku została przedstawiona metodologia prowadzenia walidacji metod analitycznych, wraz z dokładnym opisem poszczególnych parametrów walidacyjnych. Dopuszczalne jest wykorzystanie walidacji matrycowej, ale wówczas należy w protokole walidacji dokładnie opisać zastosowane podejście wraz z odpowiednim naukowym uzasadnieniem. Jeżeli walidacja jest związana z wydaniem nowej metody badania musi ona zostać załączona do protokołu. W przypadku zastosowania kryteriów akceptacji znacznie różniących się od tych zalecanych w niniejszym Przewodniku, wymagane jest zamieszczenie w protokole walidacji odpowiedniego uzasadnienia dla takiej zmiany. Jeżeli metodyka prowadzenia badań walidacyjnych będzie odbiegać od tej opisanej w metodzie, wszelkie odstępstwa muszą zostać ujęte w protokole walidacji. Jeżeli została przeprowadzona ocena krytyczności parametrów metody musi być ona załączony do protokołu walidacji.

Walidacja metody analitycznej – sprawdzenie i zatwierdzenie protokołu

Protokół walidacji musi zostać sprawdzony przez innego niż autor pracownika. Sprawdzenie obejmuje weryfikację treści protokołu na zgodność z wymaganiami niniejszego Przewodnika. Protokół musi być zatwierdzony przed rozpoczęciem testów walidacyjnych.

Wykonanie testów walidacyjnych

Badania należy prowadzić zgodnie z opisem w metodzie badania oraz metodyką zawartą w protokole walidacji. Walidacja musi być prowadzona przez przeszkolony personel i z wykorzystaniem skwalifikowanych i skalibrowanych urządzeń analitycznych oraz zwalidowanych systemów komputerowych. Podczas walidacji należy zwracać uwagę na potencjalne nieprawidłowości w działaniu metody. Jeśli takowe wystąpią należy wyjaśnić ich przyczyny.

BADANIE PARAMETRÓW WALIDACYJNYCH METOD

Selektywność metody analitycznej

Badanie selektywności metody ma na celu wykazanie, że matryca próby (wszystkie składniki danego preparatu prócz oznaczanej substancji) nie zakłóca oznaczenia i nie wnosi interferencji. Aby to sprawdzić należy w ogólnym przypadku poddać analizie:

  • ślepą próbę
  • roztwór placebo
  • roztwór placebo wraz z zanieczyszczeniami i potencjalnymi produktami rozkładu
  • roztwór wzorca wewnętrznego (jeśli jest stosowany)
  • roztwór wzorca oznaczanej substancji
  • roztwór rzeczywistej próby
  • roztwór próby przechowywanej w tzw. warunkach stresowych lub po dłuższym okresie przechowywania

Wszystkie roztwory muszą zostać przygotowane dokładnie tak samo jak opisano to w metodzie analitycznej. Należy używać takiego samego wyposażenia oraz materiałów laboratoryjnych (np. sączki, szkło, pojemniki z tworzywa sztucznego), aby sprawdzić wpływ potencjalnych interferencji.

Badanie materiału przechowywanego w warunkach stresowych musi zostać przeprowadzone w przypadku, gdy metoda ma służyć do badania stabilności oraz w przypadku braku informacji o potencjalnych produktach rozkładu lub, gdy te substancje nie są dostępne.

W przypadku braku możliwości uzyskania placeba można sprawdzić selektywność metody przez porównanie z wynikami uzyskanymi w oparciu o metodę zmodyfikowaną w sposób umożliwiający poprawę selektywności. W przypadku metod chromatograficznych modyfikacja taka może polegać na zmianie mocy elucji fazy, zastosowaniu kolumny o wyższej sprawności lub zmianę gradientu temperatury (chromatografia gazowa). Można również oprzeć się na porównaniu z wynikami uzyskanymi przy wykorzystaniu innej zwalidowanej metody.

Techniki chromatograficzne umożliwiają stosunkowo łatwy sposób oceny selektywności, dzięki możliwości ilościowej oceny rozdziału poszczególnych pików. W przypadku, gdy powierzchnia piku interferującego jest większą niż 1,0% powierzchni piku oznaczanej substancji (0,5% w przypadku analizy surowców) na poziomie nominalnego stężenia analitu, rozdzielczość pomiędzy tymi pikami musi wynosić nie mniej niż 1,5 (piki o powierzchniach znacznie różniących się) oraz 1,2 (piki o powierzchniach zbliżonych). W przypadku oznaczania zanieczyszczeń dopuszczalny poziom interferencji wynosi do 20%, a rozdzielczość można ocenić wizualnie, przy czym musi to zostać w odpowiedni sposób udokumentowane. Dodatkowo techniki chromatograficzne umożliwiają sprawdzenie tzw. czystości pików, co polega na wykazaniu, że dany pik, a tym samym sygnał analityczny, pochodzi jedynie od oznaczanego analitu. W tym celu można wykorzystać techniki spektroskopowe, pozwalające na uzyskanie widma charakterystycznego dla danej substancji (MS, UV-VIS, NMR, IR). Porównanie widm uzyskanych w różnych miejscach piku pozwala na wnioskowanie o jego czystości.

Dla prostych testów służących do identyfikacji potwierdzeniem ich selektywności będzie rezultat pozytywny badania próbki, o której wiemy, że zawiera oznaczaną substancję w połączeniu z rezultatem negatywnym dla próby, która nie zawiera tej substancji, ale występują w niej potencjalne substancje interferujące.

Zakres metody analitycznej

Zakres metody jest to przedział stężenia analitu, w którym metoda pozwala na uzyskiwanie odpowiednio dokładnych i precyzyjnych rezultatów. Zakres metody określa się na podstawie rezultatów liniowości, odzysku i precyzji. Dla substancji aktywnych i pomocniczych (występujących w ilościach wyższych niż śladowe) zakres obejmuje przedział, w obrębie którego wyznaczono akceptowalny poziom odzysku. W przypadku zanieczyszczeń obejmuje przedział od LOQ do najwyższego stężenia wykorzystanego do badania liniowości.

Wymagany zakres metody jest ściśle związany z charakterem oznaczenia i z limitami przewidzianymi w specyfikacji danego produktu i surowca. Generalnie powinien on obejmować stężenia co najmniej o 10% niższe niż najniższe stężenie i analogicznie o 10% wyższe niż najwyższe stężenie, które będzie oznaczane w oparciu o daną metodę. Stężenia ta wynikają wprost z limitów przewidzianych w specyfikacji dla danego materiału. Na potrzeby badania zakresu nie ma potrzeby przygotowywania dodatkowych prób, należy oprzeć się na rezultatach badania liniowości, dokładności i precyzji, a w przypadku zanieczyszczeń dodatkowo limitu oznaczalności (LOQ). Parametry te opisane są w kolejnych rozdziałach niniejszego Przewodnika.

Liniowość metody analitycznej

Badanie liniowości ma za zadanie wykazać, że sygnał analityczny jest proporcjonalny do stężenia oznaczanej substancji. Zakres liniowości pozostaje w związku z zakresem metody, przy czym wymagane jest aby warunek liniowości był spełniony w przedziale szerszym niż sam zakres metody. Zalecane jest aby było to przedział co najmniej 20% szerszy (chodzi o procent nominalnego stężenia) w stosunku do zakresu metody. Dla metod do badania zawartości i jednolitości zawartości zalecany jest przedział 50%-150% NS. Liniowość powinna zostać sprawdzona dla co najmniej pięciu poziomów stężenia, przy czym możliwe jest wykorzystanie do badań liniowości próbek przygotowanych na potrzeby wyznaczania poziomu odzysku (3 próby na 3 poziomach stężenia), należy wówczas dodatkowo przygotować po 2 próby na dwóch kolejnych poziomach stężenia. Możliwe jest również badanie liniowości z wykorzystaniem roztworów czystej substancji wzorcowej, o analogicznych stężeniach.

Jeżeli zostanie stwierdzone, że metoda nie jest liniowa należy określić tego przyczynę. Najczęstsze przyczyny braku liniowości to: nadmierne stężenie analitu, zbyt silny sygnał pochodzący od rozpuszczalnika, źle dobrana częstotliwość próbkowania detektora oraz niewłaściwy sposób integracji lub niedostateczny rozdział pików. W grę mogą wchodzić również zagadnienia typowo chemiczne, takie jak słaba rozpuszczalność oznaczanego związku, czy też możliwość tworzenia aglomeratów. W przypadku trudności z zapewnieniem liniowości do poziomu 150% nominalnego stężenia, można ograniczyć się do poziomu o 10% wyższego niż górny limit przewidziany w specyfikacji, ale nie mniej niż 120% NS. Należy wówczas udokumentować ten fakt nie tylko w raporcie walidacyjnym, ale również w samej metodzie analitycznej.

W przypadku testów granicznych (lll-cia kategoria metod analitycznych) nie ma konieczności badania liniowości, ale metoda analityczna musi pozwalać na rozróżnienie próbek spełniających założone kryterium, od tych, które go nie spełniają.

Nie jest również wymagane wyznaczanie liniowości dla wszystkich zanieczyszczeń, a jedynie dla wybranych substancji. Warunkiem jest aby piki związków, dla których nie zbadano liniowości, miały podobny kształt i sposób integracji jak te uwzględnione w badaniu liniowości.

W ramach badania liniowości należy wykreślić zależność między stężeniem analitu a sygnałem analitycznym oraz wykres składników resztowych (błędów korelacji), z ang. residual plot. Jest tozależność miedzy wartościami sygnału przewidzianymi na podstawie równania korelacji, a tymi wyznaczonymi doświadczalnie.

Kryterium akceptacji w przypadku badania liniowości obejmuje:

  • wartość współczynnika determinacji (r2)
  • wartość stosunku wyrazu wolnego (b) w równaniu korelacji (y = ax+b) do wartości sygnału na poziomie 100% nominalnego stężenia
  • ocenę liniowości wykresu składników resztkowych, tzn. brak trendu wskazującego na obecność czynników nieliniowych w zależności stężenie – sygnał analityczny

Jeśli metoda nie spełnia wymienionych kryteriów nie jest możliwe korzystanie z jednopoziomowej kalibracji i konieczne staje się wyznaczenie krzywej kalibracji przed lub w trakcie każdej analizy.

Dokładność (odzysk) metody analitycznej

Badanie odzysku polega na sprawdzeniu, czy sygnał analityczny mierzony w metodzie odpowiada dokładnie tej ilości analitu, która w rzeczywistości jest obecna w badanym materiale. Optymalizacja w zakresie poziomu odzysku powinna być przeprowadzona na etapie opracowywania metody analitycznej. W przypadku metod oznaczania składników aktywnych w surowcach nie ma potrzeby badania odzysku, gdyż stanowią one praktycznie czystą substancję. Wyjątek stanowią surowce, mające formę roztworów lub mieszanin, w których analizowana substancja jest jedynie jednym ze składników. Nie jest również wymagane badanie odzysku dla każdego z zanieczyszczeń, jeśli ich zawartość jest przeliczana na główny składnik. Wystarczy wówczas wyznaczyć poziom odzysku dla wybranego zanieczyszczenia. W przypadku konieczności raportowania wyniku jako %w/w wszystkie zidentyfikowane zanieczyszczenia muszą mieć wyznaczone względne współczynniki odpowiedzi (z ang. Relative Response Factor) w odniesieniu do głównego składnika. Jeśli ich wartości wykraczają poza przedział 0,8-1,2 konieczne jest wprowadzenie tych współczynników do metody analitycznej, w przeciwnym przypadku przyjmuje się równe 1. Nie należy opracowywać metod wyznaczania zawartości zanieczyszczeń w przeliczeniu na główny składnik, jeśli wartości współczynnika RRF wykraczają poza przedział 0,2-5,0. Współczynniki odpowiedzi definiowane są jako stosunek sygnału analitycznego (powierzchnia piku, absorbancja, objętość titranta) do stężenia danego związku. W przypadku technik umożliwiających wielokrotną analizę przygotowanej próbki, np. kilkukrotne nastrzyki w chromatografii, należy wykonać co najmniej po dwa (zalecane trzy) oznaczenia dla każdej próbki. Do obliczeń należy wówczas wykorzystać wszystkie uzyskane wyniki, bez uśredniania. Uwaga ta znajduje zastosowanie również w przypadku badania powtarzalności. Dopuszczalne są trzy, opisane niżej, sposoby badania dokładności:

  • Metoda dodatku analitu do placeba

Metoda polega na dodaniu oznaczanej ilości substancji wraz ze znanymi zanieczyszczeniami i/lub produktami rozkładu do masy placebo, a następnie przeprowadzenie oznaczenia w oparciu o walidowaną metodę analityczną. W przypadku metody dla zanieczyszczeń można wykorzystać placebo zawierające składniki czynne na poziomie 100% NS lub rzeczywisty surowiec / produkt końcowy, przy czym nie może on zawierać oznaczanego zanieczyszczenia.

Substancje wzorcowe powinny być dodawane w formie odpowiadającej postaci preparatu, np. jeśli preparat nie rozpuszcza się w całości w zastosowanym rozpuszczalniku, oznaczana substancja nie powinna być dodawana w roztworze, lecz w czystej formie. Jeśli nie jest to możliwe, np. ze względu na konieczność dodatku bardzo małych ilości wzorca, wówczas należy w miarę możliwości stosować łatwo lotne rozpuszczalniki, aby mogły odparować przed przystąpieniem do analizy.

W przypadku technik nieniszczących, umożliwiających bezpośrednie badanie ocenianego materiału, próby placebo z dodatkiem wzorca należy przygotować w tej samej postaci w jakiej będzie analizowany badany materiał.

  • Metoda porównawcza – wewnętrzna

Badanie polega na porównaniu wyników oznaczenia zawartości analitu w tej samej homogennej próbie, uzyskanych dla warunkach przewidzianych w walidowanej metodzie oraz zmodyfikowanych w sposób pozwalający na pełniejszy odzysk analitu. Sugerowane zmiany to np. wydłużenie czasu ekstrakcji, zwiększenie objętości ekstrahenta lub ilości cykli ekstrakcji, bardziej efektywna homogenizacja, wykorzystanie ultradźwięków itp.

  • Metoda porównawcza – zewnętrzna

Porównanie z rezultatami uzyskanymi w oparciu o inną posiadającą odpowiednią dokładność zwalidowaną metodę, która może być wykorzystana do tego samego oznaczenia. Zalecane jest przeprowadzenie równoległych testów w oparciu o te same próby, a następnie ocenę statystyczną zgodności wyników metody walidowanej z referencyjną.

Precyzja metody analitycznej

Przedstawiony sposób badania precyzji można stosować zarówno dla głównych składników jak i zanieczyszczeń, w odniesieniu do surowców i produktów farmaceutycznych. Zmianie podlegają jedynie kryteria akceptacji. W przypadku badania precyzji ważne jest aby analizowany materiał posiadał dostatecznie dużą homogenność, tak aby zmienność samej próby nie wpływała na rezultaty badania. Na precyzję metody składa się powtarzalność, precyzja pośrednia oraz odtwarzalność.

  • Powtarzalność

Badanie powtarzalności ma na celu wykazanie, że rozrzut wyników uzyskanych przez jednego analityka dla równolegle przygotowanych prób i z wykorzystaniem tych samych urządzeń laboratoryjnych i odczynników spełnia założone kryteria. Zalecane jest przeprowadzenie badania precyzji na tych samych poziomach stężenia jak dla dokładności. Można oprzeć się na wynikach badania odzysku, wyrażonych w procentach. W przypadku jeśli badanie odzysku jest realizowane przez analizę porównawczą, alternatywnie można zbadać precyzję dla sześciu prób na poziomie 100% nominalnego stężenia. Kryterium akceptacji jest względne odchylenie standardowe (RSD) uzyskanych rezultatów, obliczone z uwzględnieniem wszystkich wyników oznaczeń dla każdej próby.

  • Precyzja pośrednia

Precyzja pośrednia metody pozwala wnioskować o zmienności wyników, które będą uzyskiwane w przyszłości, podczas rutynowego stosowania metody przez różne osoby i z wykorzystaniem różnego sprzętu analitycznego. Badania precyzji pośredniej powinny być prowadzone przez minimum dwóch różnych analityków, w innym dniu, z wykorzystaniem innych urządzeń (np. inny egzemplarz lub typ), odczynników, roztworów wzorcowych i akcesoriów analitycznych, np. kolumn chromatograficznych. Kryteria akceptacji obejmują RSD dla danej grupy wyników (inny analityk, sprzęt, dzień) oraz różnicę między wartością średnią dla danego testu, a średnią dla warunków referencyjnych. Jako warunki referencyjne należy rozumieć analityka i sprzęt analityczny wykorzystany w trakcie badania powtarzalności. Badania te można rozszerzyć, na przykład angażując większą liczbę analityków lub urządzeń. Można także przeprowadzić badania w oparciu o kombinacje różnych czynników. W przypadku konieczności sprawdzenia wpływu większej liczby czynników zalecane jest wykorzystanie metod statystycznego planowania eksperymentu do przygotowania planów doświadczeń, a następnie analizy wariancji ANOVA do oceny uzyskanych rezultatów.

  • Odtwarzalność

Badanie odtwarzalności oraz kryteria akceptacji są analogiczne jak dla precyzji pośredniej, jedyną różnicę stanowi wymaganie aby test był wykonany przez różnych analityków w dwóch różnych laboratoriach. W przypadku wykazania odtwarzalności metody nie ma potrzeby badania precyzji pośredniej.

Limit detekcji (LOD) metody analitycznej

Dopuszczalne jest wykorzystanie kilku alternatywnych metod wyznaczania limitu detekcji, które opisano poniżej.

  • Ocena wizualna

Sposób ten nie jest zalecany, a jego wykorzystanie jest dozwolone jedynie w przypadku technik nieinstrumentalnych. Polega on na ocenie wizualnej jakie najmniejsze stężenie analitu w próbce pozwala na jego wiarygodną detekcję, np. w przypadku oceny występowania plamki w technice TLC.

  •  Ocena stosunku sygnału do szumu

Metoda polega na pomiarze stosunku sygnału do szumu, przy czym za limit detekcji uznawane jest takie stężenie analitu, dla którego stosunek ten wynosi 3:1.Jest to zalecana metoda wyznaczania LOD dla technik instrumentalnych, ale jej zakres stosowania jest ograniczony do metod, które pozwalają na wizualizację szumu linii bazowej.W przypadku oceny wizualnej lub wykorzystania stosunku sygnału do szumu konieczne jest udokumentowanie uzyskanych rezultatów (zdjęcie płytki TLC, chromatogram).

Jeśli zawartość zanieczyszczenia jest obliczana metodą normalizacji (techniki chromatograficzne) możliwe jest podawanie limitu detekcji jako procentu powierzchni głównego piku. W przypadku konieczności raportowania wyniku jako procent wagowy (co jest zalecane), konieczne jest wyznaczenie dla danego zanieczyszczenia współczynnika RRF.

  • Pomiar odchylenia standardowego sygnału

Metoda ta jest najbardziej uniwersalna i może zostać zastosowana do wielu technik analitycznych. Jako wartość a można przyjąć: odchylenie standardowego sygnału analitycznego dla co najmniej 6-ciu pomiarów roztworów ślepej próby, odchylenie standardowe dla wartości składników resztowych (błędów) równania krzywej kalibracyjnej wyznaczonego w trakcie badania liniowości, odchylenie standardowe wartości wyrazu wolnego w równaniu krzywej kalibracyjnej. Badanie limitu detekcji należy prowadzić na próbach przygotowanych przez dodatek zanieczyszczenia do placebo lub badanego materiału, przy czym w tym drugim przypadku należy wykazać wcześniej brak obecności zanieczyszczeń.

Limit oznaczalności (LOQ) metody analitycznej

Sposoby wyznaczania limitu oznaczalności są analogiczne do tych dla limitu detekcji. Obowiązują jedynie inne kryteria akceptacji, a mianowicie stosunek sygnału do szumu powinien wynosić 10:1. Dodatkowo zalecane jest sprawdzenie precyzji metody na poziomie stężenia odpowiadającym LOQ.

Pomiędzy wartościami LOQ a LOD istnieje następująca zależność: LOQ = 3 x LOD

W oparciu o nią możliwe jest wzajemne przeliczanie tych parametrów, o ile tylko jeden z nich zostanie wyznaczony doświadczalnie.

Wartości limitów detekcji i oznaczalności są uzależnione od wykorzystywanej aparatury analitycznej. Dlatego też zalecane jest wprowadzenie do metody analitycznej każdorazowego badania roztworu sprawdzającego wyznaczony poziom LOD i /lub LOQ. Dotyczy to szczególnie oznaczeń opartych na metodzie normalizacji.W przypadku złożonej matrycy próby lub skomplikowanej procedury analitycznej do wyznaczania limitu oznaczalności/detekcji powinno się wykorzystywać próby placeba z dodatkiem odpowiedniej ilości oznaczanej substancji. Taką próbkę należy poddać pełnej analizie zgodnie zwalidowaną metodą. Wykorzystanie jedynie roztworów przygotowanych przez rozpuszczenie substancji wzorcowej jest niewystarczające i może prowadzić do przyjęcia w metodzie błędnego stężenia LOO/LOD, zazwyczaj zbyt niskiego.

Odporność metody analitycznej

Przez odporność metody analitycznej należy rozumieć poziom wrażliwości uzyskiwanych w oparciu o nią wyników na niewielkie zakłócenia w sposobie prowadzenia analizy lub warunkach pomiaru. Dodatkowo w zakres badania odporności włączone jest zagadnienie stabilności roztworów prób i wzorców. W trakcie badania odporności należy sprawdzać wpływ zmian takich parametrów, które na bazie naukowych przesłanek lub w oparciu o wyniki badań zostały uznane za istotne dla danej metody. Mogą to być parametry detekcji, prowadzenia analizy, przygotowania roztworu próby lub inne, w zależności od potrzeb. Informacje z zakresu odporności metody powinny zostać zawarte nie tylko w raporcie walidacyjnym, ale również w samej metodzie analitycznej, co pozwoli zwiększyć elastyczność metody i może niezbędne do spełniania wymogów testów SST.Odporność metody powinna być sprawdzona już na etapie jej opracowania, a w zakres walidacji należy włączyć jedynie najbardziej krytyczne parametry.

  • Stabilność roztworów wzorcowych i prób

Do oceny stabilności roztworów wzorcowych i prób zalecane jest przygotowanie, co najmniej dwóch równoległych roztworów i analizowanie ich stężenia po określonym okresie przechowywania, w oparciu o świeżo przygotowane roztwory substancji wzorcowych. W przypadku metod automatycznych należy ocenić stabilność stosowanego wzorca/przygotowanej próby w warunkach możliwie odwzorowujące rzeczywiste środowisko analizy.

  • Test sączków/filtrów

W badaniu należy wykazać, że użyte filtry/sączki gwarantują odpowiednią powtarzalność procesu sączenia i nie wpływają na wynik analizy. Zalecane jest sprawdzenie sączków pochodzących z minimum dwóch różnych serii lub od różnych dostawców. Badanie należy przeprowadzić na minimum 2 roztworach próby dla każdego typu lub serii sączka/filtra.

W przypadku metod z automatycznym przygotowaniem próby, gdzie filtr nie jest wymiany po każdej próbie, a dopiero po cyklu próbek, należy dodatkowo wykazać, że filtracja jest tak samo skuteczna na początku i końcu całego cyklu.

  • Badanie odparowania rozpuszczalnika – tylko dla metod automatycznych

Badanie wpływu odparowania należy przeprowadzić w przypadku stosowania układów automatycznych, w których roztwór wzorca i/lub próby nie jest umieszczony w szczelnym naczyniu w trakcie trwania analizy. W celu zbadania szybkości odparowania rozpuszczalnika należy sprawdzić szybkość odparowania w warunkach prowadzenia analizy lub warunkach stresowych, które zagwarantują wiarygodność testu. Przeprowadzić minimum dwa oznaczenia.

  • Przeniesienie próby – tylko dla metod automatycznych

Przeniesienie próby jest parametrem związanym z automatycznymi procesami umożliwiającymi sekwencyjne przygotowanie/analizowanie próbek. Test ma na celu wykazać, że aparat nie przenosi substancji badanej z poprzedniego testu do kolejnego, który wykonywany jest w jednej sekwencji. Procedurą zapewniającą brak przeniesienia próby jest procedura automatycznego mycia układu między analizami. Jako kryterium akceptacji zakłada się maksymalną ilość substancji, jaka może być przeniesiona między kolejnymi analizami. Do oceny przeniesienia zalecane jest utworzenie sekwencji składającej się z przygotowania roztworów na bazie rzeczywistych próbek (minimum trzech próbek w przypadku analizy uwalniania i 6 w przypadku przygotowania roztworów dla oznaczenia zawartości zanieczyszczeń) oraz przygotowania roztworu z ominięciem próby (roztworu blanku). Zalecane jest również, aby parametr przeniesienia był oceniany podczas badania odporności metody na zmianę parametrów metody. Parametry związane z procesem mycia jak liczba przepłukać, objętość czynnika myjącego, temperatura, czas mycia mogą mieć kluczowe znaczenie na przeniesienie próby miedzy poszczególnymi analizami. Badanie przeniesienia próby powinno być wykonywane dla następujących aparatów: aparat do automatycznego przygotowania próby, aparat do uwalniania z kolektorem frakcji, aparat do uwalniania sprzężony z UV lub HPLC.

  • Brak interferencji układu – tylko dla metod automatycznych

Analiza interferencji układu ma na celu wykazać, że urządzenie nie wnosi interferencji względem oznaczanych substancji. W tym celu należy wykonać analizę z użyciem roztworu bez oznaczanych substancji. Konieczne jest wykonanie minimum dwóch powtórzeń.

  • Odporność metody na zmiany parametrów prowadzenia analizy

W trakcie badania odporności należy sprawdzać wpływ zmian takich parametrów, które na bazie naukowych przesłanek lub w oparciu o wyniki badań zostały uznane za istotne dla danej metody. Mogą to być parametry detekcji, prowadzenia analizy, przygotowania roztworu próby lub inne, w zależności od potrzeb. Wielkości zmian testowanych parametrów zależą od planowanego wykorzystania metody analitycznej i jej specyfiki. Wybór parametrów powinien być poparty przeprowadzoną analizą pływu czynników na parametry walidacyjne metody. Ocena ryzyka musi zostać udokumentowana w protokole i raporcie walidacji metody. W trakcie badania odporności zalecane jest sprawdzenie wpływu poszczególnych czynników w możliwie szerokim zakresie, aby zagwarantować dużą przestrzeń projektową metody.

W przypadku konieczności wykonania dużej liczby testów zalecane jest wykorzystanie metod statystycznego planowania eksperymentu do przygotowania planów doświadczeń, a następnie analizy wariancji ANOVA do oceny uzyskanych rezultatów. Liczba parametrów, jaka ma być uwzględniona w jednym planie eksperymentu jest uzależniona od możliwości sprzętowych aparatu, stabilności analizowanych roztworów, objętości zużywanej fazy. Jest zalecane, aby liczba analizowanych parametrów nie przekraczała 6. W przypadku wytypowania większej liczby parametrów, jakie powinny być ocenione podczas eksperymentu zalecane jest podzielenie eksperymentu na dwa mniejsze. Jako parametry oceniane – wyniki po przeprowadzonym eksperymencie, zalecane jest przeanalizowanie, oprócz zawartości badanej substancji, również innych parametrów, np. rozdzielczość, ogonowanie pików.

Zalecanymi planami eksperymentów, służącymi do badania odporności metody, są plany frakcyjne dwupoziomowe. Każdy z analizowanych parametrów oceniany jest na dwóch poziomach (-1.+1) wyznaczonych przez zakres zmienności. Pozwalają one na uzyskanie informacji o wpływie zmian parametrów na wyniki uzyskiwane daną metodą przy możliwie małej liczbie eksperymentów. W każdym planie eksperymentu muszą występować minimum 3 oznaczenia dla punktu centralnego, czyli nominalnych wartości parametrów metody. W przypadku testu odporności przygotowania próby dla każdego punktu planu należy przygotować minimum 2 próby. W przypadku badania odporności samego układu pomiarowego (np. chromatograf) należy wykonać po minimum 2 pomiary wzorca i próby. Jeżeli odporność metody jest testowana w oparciu o statystyczne planowanie eksperymentu kryteria akceptacji powinny obejmować różnicę wyników uzyskanych dla poszczególnych badań (na poziomach -1,+1), a wynikiem średnim w punkcie centralnym, statystycznie wyznaczony wpływ poszczególnych zmiennych w przedziale od punktu centralnego do granicy badanego zakresu, np. procentowy wpływ, na wynik analizy, zmiany objętości nastrzyku od wartości nominalnej do maksymalnej wartości przyjętej w badaniu odporności.

  • Testy przydatności systemu (SST)

Testy przydatności systemu (z ang. system suitability tests) to zespół testów/sprawdzeń, które rutynowo, podczas każdej analizy, należy wykonać w celu wykazania, że uzyskiwane wyniki będzie można uznać za wiarygodne. Kryteria akceptacji dla testów SST są nazywane kryteriami przydatności systemy (z ang. system suitability criteria). W trakcie walidacji należy zdefiniować i zweryfikować (jeśli nie wykonano tego podczas opracowania metody) odpowiednie testy i kryteria przydatności systemu. Testy SST muszą być zdefiniowane dla wszystkich instrumentalnych metod analitycznych. Rodzaj testów i wartości kryteriów należy dobrać w oparciu o charakterystykę metody oraz w zależności od jej planowanego wykorzystania. Dla wszystkich metod separacyjnych wykorzystujących roztwory wzorcowe muszą być wprowadzone, co najmniej dwa parametry przystosowania systemu – parametr charakteryzujący precyzję systemu (np. precyzja nastrzyku wzorca) oraz parametr opisujący sprawność rozdziału (np. rozdzielczość, ogonowanie piku, liczba półek teoretycznych). W przypadku oznaczania zanieczyszczeń zalecane jest wprowadzenie do metody testu sprawdzającego czułość systemu (LOQ/LOD).


Przygotowanie raportu z walidacji metody analitycznej

Raport z walidacji metody analitycznej musi dokumentować:

  • zdefiniowane w protokole kryteria akceptacji
  • rezultaty uzyskane w trakcie badania parametrów walidacyjnych
  • ocenę spełnienia kryteriów akceptacji
  • odniesienie do odpowiedniego protokołu walidacji
  • odniesienie do danych źródłowych, które posłużyły do przygotowania raportu
  • stwierdzone niezgodności z założonymi kryteriami akceptacji
  • wszelkie odchylenia od zdefiniowanej w protokole metodyki badań i kryteriów akceptacji, wraz z oceną wpływu tych odchyleń na wiarygodność przeprowadzonego procesu walidacji – w punkcie niezgodności
  • stwierdzenie podsumowujące, dopuszczające lub wykluczające zastosowanie danej metody do zdefiniowanego wcześniej celu

W przypadku, jeśli walidacja kończy się z wynikiem negatywnym w raporcie dodatkowo należy zawrzeć analizę zaistniałego problemu wraz z planem działań korygujących (np. wprowadzenie zmian do metody analitycznej). Wszelkie zmiany kryteriów akceptacji dokonane już po przeprowadzeniu badań walidacyjnych muszą zostać udokumentowane wraz z odpowiednim uzasadnieniem.

Raport z walidacji metody analitycznej w wersji rozszerzonej powinien dodatkowo zawierać:

  • dane na temat wykorzystanej aparatury, odczynników oraz innych materiałów laboratoryjnych
  • informację o stężeniach analizowanych roztworów oraz sposobie ich przygotowania
  • uzyskane charakterystyczne widma, chromatogramy lub zdjęcia płytek TLC
  • wykresy i rysunki wymagane na potrzeby walidacji
  • uzyskane poszczególne wyniki, a nie jedynie wartości średnie
  • statystyczną obróbkę wyników (np. RSD, przedziały ufności, rozstępy)

Sprawdzenie raportu z walidacji i zatwierdzenie dokumentacji walidacyjnej

Raport z walidacji metody musi zostać sprawdzony przez innego niż autor pracownika, przeszkolonego z niniejszego Przewodnika. Sprawdzenie obejmuje:

  • kompletność danych w odniesieniu do protokołu walidacji
  • wszystkie obliczenia
  • poprawność przeniesienia danych źródłowych

Zatwierdzenie raportu z walidacji metody analitycznej w przypadku pozytywnego wyniku walidacji jest równoznaczne z dopuszczeniem metody do użytkowania.

Aktualizacja rejestru walidacji/transferów metod analitycznych

Rejestr obejmuje wszystkie metody wykorzystywane w laboratorium wraz z ich statusem walidacyjnym i odniesieniem do dokumentacji walidacyjnej/transferowej.

Rejestr powinien zawierać następujące informacje:

  • nazwę surowca / produktu dla którego stosowana jest metoda analityczna
  • numer i tytuł metody
  • informacje o typie metody i rodzaju oznaczenia
  • status walidacyjny
  • odniesienie do dokumentacji walidacyjnej lub transferowej
  • data walidacji
  • termin następnego przeglądu walidacji

Rewalidacja metody analitycznej

Rewalidacja metody analitycznej musi być prowadzona i dokumentowana w sposób analogiczny jak sam proces walidacji metody analitycznej. Zakres rewalidacji metody musi zostać dobrany odpowiednio do wprowadzonych zmian, naukowo uzasadniony i udokumentowany w protokole walidacji. Do oceny konieczności rewalidacji i zdefiniowania jej zakresu zalecane jest przeprowadzenie analizy ryzyka oraz wykorzystanie stosowanych w tym celu narzędzi. Typowe przypadki, w których może być wymagana rewalidacja metody analitycznej to:

  • zmiany w technologii syntezy składników aktywnych (kwestia zanieczyszczeń)
  • zmiany składu produktu gotowego
  • zmiany w procedurze analitycznej lub urządzeniach pomiarowych
  • zmiany limitów specyfikacji
  • wykorzystanie metody do badania innego produktu / surowca

W przypadku metod do weryfikacji czyszczenia należy zwrócić szczególną uwagę na zmiany zakresu w związku z innym limitem pozostałości zanieczyszczenia, badanie nowego rodzaju powierzchni, zmiany techniki próbkowania lub stosowanych tamponów analitycznej. Wszelkie zmiany dokonane w metodzie analitycznej, odbiegające od wyznaczonego dla niej zakresu dopuszczalnej modyfikacji, muszą podlegać formalnej kontroli zmian. Ocena konieczności przeprowadzenia rewalidacji metody analitycznej powinna być zamieszczona w odpowiedniej karcie kontroli zmian.

Zarządzenie plikami Cookies

Pliki Cookies są wyłączone.
Włącz pliki Cookies klikając "Akceptuję" w okienku komunikatu.

Więcej o ustawieniach prywatności

Strona domyślnie nie używa ciasteczek (cookies). Możesz zaakceptować cookies, aby umożliwić poprawne działanie wybranych funkcjonalności serwisu. Więcej informacji

The cookie settings on this website are set to "allow cookies" to give you the best browsing experience possible. If you continue to use this website without changing your cookie settings or you click "Accept" below then you are consenting to this.

Close